Analyse structurale des oligosaccharides

Avant l'avènement des techniques physiques d'analyse structurale (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire), la structure d'un oligosaccharide pouvait être déterminée par une combinaison de méthodes biochimiques.

  1. Détermination de la composition molaire et centésimale en oses constitutifs,

  2. Détermination de l'enchaînement des monomères (1 4, 1 6, etc...),

  3. Détermination de l'anomérie des liaisons (α, β).

Une hydrolyse acide libère les oses constitutifs, et permet de déterminer la composition d'un oligosaccharide.

La liaison O-glycosidique (acétal) est sensible à l'hydrolyse acide (voir Additions réversibles). L'hydrolyse acide totale (en solution HCl concentrée, à 100-110°C pendant plusieurs heures) rompt les liaisons glycosidiques sans endommager les oses. Ceux-ci peuvent ensuite être séparés de l'hydrolysat par diverses techniques chromatographiques (en couche mince, en veine liquide ou en phase gazeuse), identifiés et dosés par les méthodes colorimétriques adaptées.

La composition molaire (fraction de mole de chaque ose par mole d'oligosaccharide) et la composition centésimale (pourcentage en masse de chaque ose dans l'oligosaccharide) sont déduites des résultats des dosages.

La perméthylation permet de déterminer l'enchaînement des monomères.

La perméthylation (voir Ethers et esters) est une procédure fiable d'identification des hydroxyles impliqués dans les liaisons glycosidiques. Etant pris dans les liaisons, ceux-ci sont en effet protégés de la réaction, et l'hydrolyse acide réalisée dans un second temps libère un mélange d'oses partiellement méthylés. La séparation, l'identification et le dosage de ces dérivés permettent de retrouver l'enchaînement des monomères.

Complément

Un disaccharide réducteur est constitué de D-galactose et de D-glucose. La perméthylation, suivie d'hydrolyse acide, libère du 2,3,4,6-tetra-O-méthyl D-galactose et 2,3,6-tri-O-méthyl D-glucose. Indépendamment du fait que l'hydrolyse acide ne respecte aucune méthylation en C1, les profils de méthylation des deux oses ne laissent aucun doute sur l'enchaînement D-galactopyranosyl-(1 4)-D-glucopyranose. La configuration anomérique de la liaison sera précisée par l'emploi de glycosidases.

Il subsiste parfois une ambigüité au niveau des carbones anomériques. Dans les conditions de la perméthylation, les hémiacétals réagissent au même titre que les alcools mais donnent des méthyl glycosides sensibles à l'hydrolyse acide, alors que les éthers méthyliques formés sur les alcools sont résistants. L'absence de méthylation sur un carbone anomérique après hydrolyse n'est donc pas la preuve formelle de son engagement dans une liaison glycosidique (voir l'exemple du D-glucose dans l'animation ci-dessus).

Dans la majorité des cas, l'ambigüité sur un carbone anomérique peut être levée par le recoupement des données. Sinon, il est toujours possible de réduire l'oligosaccharide entier par le borohydrure de sodium (voir Réduction des oses). Seul un hémiacétal (carbone anomérique) libre est sensible à la réduction et donne un alditol dont le dérivé méthylé, résistant à l'hydrolyse (car de type éther), identifie le résidu réducteur.

Dans le cas d'un oligosaccharide essentiellement constitué d'aldoses, l'existence d'un hémiacétal libre est aussi détectable par le pouvoir réducteur sur les oxydes métalliques (voir Oxydation des oses).

L'emploi de glycosidases permet de déterminer l'anomérie des liaisons.

Il existe un grande variété d'enzymes capables de reconnaître un oside dans une configuration anomérique donnée, α ou β, et de catalyser spécifiquement l'hydrolyse de la liaison glycosidique correspondante. Ces enzymes sont des glycosyl hydrolases, ou plus simplement, des glycosidases.

Certaines de ces enzymes n'agissent que sur les extrémités non réductrices des glucides. On les appelle exoglycosidases, par opposition aux endoglycosidases qui, elles, sont capables d'hydrolyser des liaisons situées à l'intérieur des molécules. Quelques exo- et endoglycosidases courantes sont présentées dans le tableau suivant, avec leurs spécificités de reconnaissance.

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